Plen anfle nan résine a
Peze 2.0 g vid Wang résine nan yon tib reyaksyon pwòp epi sèk, ajoute 15 mL DMF, deklanchman tanperati chanm 30 min sou.
Pran premye asid amine
Nan tanperati chanm, filtre sòlvan ki soti nan etap anvan an atravè yon nwayo sab epi ajoute 1 mmol 5 molè depase C Premye asid amine nan fen, 5-pliye molè depase DMAP, 5 molè depase DIC, DMF Fè sòlvan reyaksyon tanperati chanm 3 h. Sèvi ak apre reyaksyon fini DMF Lave 4 ~ 6 fwa, 5-6 fwa chak fwa mL. Lè sa a, ajoute yon kantite apwopriye nan piridin ak anhydride acetic ak yon rapò volim nan 1: 1, epi reyaji pou 30 min. Sèvi ak apre reyaksyon fini DMF Lave 4 ~ 6 fwa, 5-6 fwa chak fwa mL. (efè: Bloke microdots aktif yo sou résine vid ki pa reyaktif la.)
Fmoc Depa nan gwoup pwoteksyon
Retire sòlvan an nan etap anvan an pa aspirasyon filtraj, epi ajoute 10 mL 20% piperidin DMF solisyon an ajoute nan résine a, N2 Brase 10 min Finalman, filtre solisyon an epi ajoute 10 mL 20% nan solisyon piperidin DMF, N2 Blow ak brase 5 min Lè sa a, filtre solisyon an epi repete operasyon sa a de fwa. DMF Lave 4 fwa, lave 2 fwa ak metanol, 5-6 fwa chak fwa mL.
Tès efè a retire nan ninhydrin
Wete yon ti kantite résine, lave l twa fwa ak metanol, ajoute ninhydrin, KCN, Yon gout chak nan solisyon fenol, 105 degre -110 degre Chofaj 5 min, Vire ble fonse se yon reyaksyon pozitif, ki endike ke retire elèv la fini ak pwochen etap la nan reyaksyon an ka te pote soti.; Si li san koulè, sa vle di ke gwoup la pwoteje pa te konplètman retire, epi operasyon an deprotection pi wo a bezwen repete.
Lè sa a, dezyèm asid amine ak Fmoc Pwoteksyon gwoup retire
Peze 3 fwa molè depase C Dezyèm asid amine nan fen, yon 3-pliye molè depase HBTU ak yon 3-pliye molè HOBT. Nan tib reyaksyon an, ajoute kantite DMF apwopriye Apre solisyon an fin fonn nèt, ajoute yon 10-pliye molè depase (pi) DIEA, reyaksyon tanperati chanm 40 min, sèvi ak DMF Lave 4 fwa ~ 6 fwa chak fwa. Pran yon ti kantite tès itilize résine ak reyaktif deteksyon ninhydrin epi li pral parèt san koulè, Lè sa a, ajoute 10 mL 20% nan piperidine DMF retire solisyon Fmoc, Fè sa de fwa pou 10 min, 5min, apre yo fin itilize DMF Lave 4 fwa, lave 2 fwa ak metanol, 5-6 fwa chak fwa mL. Pran yon ti kantite itilizasyon résine Sèvi ak reyaktif deteksyon ninhydrin la pou detekte li. Si deteksyon an se ble, ou ka ale nan pwochen etap la nan reyaksyon an.
Pa analoji, repete etap 2.6 jiskaske sentèz la N Retire dènye asid amine nan fen baz Fmoc Protect, epi vide.
Koule résine ak separasyon pwodwi pi bon kalite ak deteksyon
Finalman, sèvi ak solisyon koupe asid trifluoroacetic (95% TFA: 2% TIS: 2% EDT: 1% H2O) Koupe 2 h, Filtre solisyon an reyaksyon ak aspirasyon epi jwenn yon solisyon asid trifluoroacetic nan polipèptid la. Seche lysate la ak nitwojèn otank posib, presipite ak etè, santrifuje, ak Lè sa a, lave ak etè pou 3 segonn. ~5fwa, yo te jwenn yon solid blan. Apre fonn li nan dlo pi, HPLC Desal ak pirifye, friz-sèk ak presipite kristal, pran yon ti kantite MS analize.